БЕСПРИБОРНАЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

 

« вернуться к странице сферы

БЕСПРИБОРНАЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

ПРИ ПОМОЩИ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

     Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острое вирусное заболевание, характеризующееся системным поражением мелких сосудов, геморрагическим диатезом, гемодинамическими расстройствами и своеобразным поражением почек (интерстициальный нефрит с развитием острой почечной недостаточности). В Российской Федерации (РФ) ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозных инфекций и одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. На территории Республики Башкортостан (РБ) природные очаги ГЛПС считаются самыми активными и крупными в России. Ежегодно в РБ заболевает ГЛПС в среднем до 2500 человек (около 60% больных ГЛПС по РФ). В 2005 году заболеваемость ГЛПС в РБ составила 56,52 на 100 тысяч населения. Учитывая это, встает вопрос о максимально ранней постановке диагноза и начале этиотропной и патогенетической терапии.

     В настоящее время специфическая лабораторная диагностика ГЛПС строится на определении нарастания титра IgG в парных сыворотках больных методами непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ), иммуноферментного анализа (ИФА) и методом флюоресцирующих антител (МФА). Методы достаточно информативны, серологическая подтверждаемость клинического диагноза достигает 96-98%. Для постановки анализа берутся парные сыворотки в первые дни болезни с интервалом 7-10 дней [1]. Стандартные методики определения титров иммуноглобулинов с помощью МФА и ИФА предполагают процедуру последовательного разведения исследуемых сывороток. Это приводит к увеличению трудоемкости методов и ограничению диагностических возможностей, поскольку для постановки диагноза необходима регистрация увеличения титра антител во второй сыворотке не менее чем в 4 раза [2]. Таким образом, для постановки диагноза ГЛПС требуется не менее 7-10 дней.

     В последнее время для ранней диагностики различных инфекционных заболеваний разрабатываются         иммунохроматографические тесты.

     Иммунохроматографический анализ (ИХА) - это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА - сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, Point-of-care (POC), экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа. Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально [3].

     Фирма «Reagena» (Финляндия) предлагает иммунохроматографические тесты для ранней и быстрой диагностики Ханта-вирусных инфекций, вызванных вирусами Puumula, Hantaan и Dobrava, позволяющие определить специфические иммуноглобулины класса М к очищенному белку нуклеокапсида соответствующего вируса всего за несколько минут. Так как в реакцию вступают только антитела IgM класса, тест определяет только острую инфекцию. IgG не влияет на результат теста. Специфичность и чувствительность бесприборного экспресс-теста колеблется от 83 до 100%. Обычно положительный результат теста может быть получен в первый же день проявления симптомов ГЛПС. В качестве исследуемого материала могут быть использованы сыворотка, плазма (гепарин или ЭДТА) или кровь из пальца [4].

     Цель исследований: оценить пригодность диагностических наборов «Бесприборный экспресс-тест PUUMALA» для выявления IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вируса Pumala (род Ханта-вирусов) и «Бесприборный экспресс- тест HANTAAN» для выявления IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вируса Hantaan (род Ханта-вирусов) производства фирмы «Reagena» (Финляндия) для серологической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом с целью их дальнейшего использования в практическом здравоохранении, а также возможное выявления циркуляции вируса Hantaan на территории РБ, где ранее выявлялся только вирус Puumala.

     Материалы и методы исследования. Анализ проводился согласно прилагаемой инструкции фирмы-изготовителя. Каждый диагностический набор представляет собой систему тест-кассет с лункой для исследуемого материала, который диффундирует по полоске бумаги, взаимодействуя с нанесенным реагентом, один из которых указывает на правильность выполненного теста (С - control - контроль), а второй на наличие IgM антител в исследуемом образце (Т). При обнаружении двух полос тест считается правильно выполненным и положительным. При обнаружении одной полосы в окне С (контроль) результат считается правильно выполненным и отрицательным. В качестве исследуемого материала использовалась сыворотка крови и капиллярная кровь. Для сравнения использовался МФА для выявления нарастания титра IgG-антител к Ханта-вирусам без разделения на классы и серотипы.

     Исследовали панель из 16 сывороток: 14 положительных образцов, исследованных МФА, показавших наличие специфических антител к Ханта-вирусам (12 образцов в титре 1/256 и 2 образца в титре 1/64) и 2 отрицательные сыворотке, в которой не было обнаружено специфических антител методом МФА. Во всех положительных образцах в последующем было выявлено нарастание титра антител в 4 и более раз, что говорило об острой инфекции, вызванной Ханта-вирусами.

      Также исследовали 10 образцов капиллярной крови больных с предположительным диагнозом ГЛПС. Исследования проводились с 3 по 10 день заболевания

     Полученные результаты. В результате проведенных исследований получены следующие данные:

  1. Во всех тест-кассетах обнаружена контрольная полоса (С), указывающая на то, что тест работает.
  2. Из 14 положительных сывороток все 14 дали положительный результат, указывающий на обнаружение IgM-антител к вирусу Puumala и все 14 дали отрицательный результат при тестировании IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вирусу Hantaan. Отрицательная сыворотка дала отрицательный результат в обоих тестах (таблица 1).

Таблица 1

Определение IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вирусов Puumala и Hantaan при помощи бесприборный экспресс-тестов

в сыворотке крови больных ГЛПС

Наличие специфических

Определение IgM-антител к очищенному белку

Определение IgM-антител к очищенному белку

 

антител к вирусу ГЛПС в МФА

нуклеокапсида вирусу Puumala

нуклеокапсида вирусу Hantaan

 

(титры)

Контроль

(С)

Тест

(Т)

Контроль

(С)

Тест

(Т)

1

1/256

+

+

+

-

2

1/256

+

+

+

-

3

1/256

+

+

+

-

4

1/256

+

+

+

-

5

1/256

+

+

+

-

6

1/64

+

+

+

-

7

1/256

+

+

+

-

8

1/256

+

+

+

-

9

1/256

+

+

+

-

10

1/256

+

+

+

-

11

1/256

+

+

+

-

12

1/64

+

+

+

-

13

1/256

+

+

+

-

14

1/256

+

+

+

-

15

Отрицательная сыворотка

+

-

+

-

16

Отрицательная сыворотка

+

-

+

-

 4. При исследовании капиллярной крови 10 пациентов с предположительным диагнозом ГЛПС в 6 образцах получены положительные результаты, указывающие на обнаружение IgM-антител к вирусу Puumala. В 4 образцах получены отрицателнье результаты, указывающие на отсутствие IgM-антител к вирусу Puumala. Все 10 образцов дали отрицательный результат при тестировании IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вирусу Хантаан. В последствие все положительные тесты были подтверждены серологически МФА. Среди отрицательных образцов в одном случае был выставлен диагноз ГЛПС серологически, а в трех других образцах были выставлены диагнозы: внебольничная пневмония, острый гломерулонефрит, хронический пиелонефрит, обострение (таблица 2).

Таблица 2

Определение IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вирусов Puumala и Hantaan при помощи бесприборный экспресс-тестов

в каппилярной крови больных с предположительным диагнозом ГЛПС

Определение IgM-антител к очищенному белку

Определение IgM-антител к очищенному белку

Последующее обнаружение

 

нуклеокапсида вирусу Puumala

нуклеокапсида вирусу Hantaan

специфических антител к вирусу

 

Контроль

(С)

Тест

(Т)

Контроль

(С)

Тест(Т)

ГЛПС в МФА (титры)

1

+

+

+

-

1/256

2

+

+

+

-

1/256

3

+

+

+

-

1/256

4

+

+

+

-

1/256

5

+

+

+

-

1/256

6

+

+

+

-

1/256

7

+

-

+

-

1/256

8

+

 

+

 

Отрицательная

сыворотка (внебольничная пневмония)

9

+

 

+

 

Отрицательная сыворотка (острый гломерулонефрит)

10

+

 

+

 

Отрицательная

сыворотка (хронический пиелонефрит, обострение)

      Таким образом, при использовании сыворотки крови в качестве исследуемого материала чувствительность «Бесприборного экспресс-теста PUUMALA» составила 100%, а при исследовании капиллярной крови чувствительность метода была 85,7%. Перекрестного реагирования либо изолированного обнаружение IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вирусу Hantaan не наблюдалось, что еще раз подтверждает доминирование вируса Puumala в этиологии геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Республики Башкортостан.

     Выводы. Диагностический набор «Бесприборный экспресс-тест PUUMALA» для выявления IgM-антител к очищенному белку нуклеокапсида вируса Pumala (род Ханта-вирусов) производства фирмы «Reagena» (Финляндия) прост и удобен в работе, не требует специального оборудования, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, может быть использован в системе практического здравоохранения. Наиболее предпочтительным является использование сыворотки крови в качестве исследуемого материала, т.к. обследование капиллярной крови обладает меньшей чувствительностью, а диффузия эритроцитов по тест-полоске затрудняет визуализацию полученных результатов. Время проведения анализа составляет не более 10 минут, что позволяет отнести его методам экспресс-диагностики.

 

     Список литературы

  1. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики / Под ред.акад. АН РБ Р.Ш.Магазова. - Уфа: Гилем,2006, с.50.
  2. С.Ю.Веселов, Л.Е.Ли, М.В.Симонян и др. Иммуноферментная диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования одного разведения сыворотки // Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики. / Материалы Всероссийской научно-практической конференции - Уфа, РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ, 2006, с.88.
  3. Lein, M., Jung, K., Schnorr, D., Henke, W., Brux, B., and Loening, S.A. Rapid screening of PSA: evaluation of an immunochemical membrane strip test [letter]. Clin.Chem. 41:1545-1547, 1995.
  4. Инструкция по применению «Бесприборный экспресс-тест PUUMALA» и Бесприборный экспресс-тест HANTAAN» производства фирмы «Reagena» (Финляндия).